Produzione di embrioni di suino geneticamente modificati mediante lipofezione di ovociti con zona pellucida intatta utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

La produzione di suini geneticamente modificati ha un impatto importante grazie alle loro applicazioni nella ricerca di base, nella biomedicina e nella produzione di carne. La clonazione è stata la prima tecnica utilizzata per questo scopo, anche se sono stati sviluppati altri metodi più semplici ed economici, come la microiniezione (microinjection), l'elettroporazione (electroporation) o la lipofezione (lipofection) di ovociti e zigoti. In questo studio, la produzione di embrioni geneticamente modificati mediante lipofezione di ovociti con zona pellucida intatta utilizzando Lipofectamine^TM CRISPRMAX^TM Cas9 è stata analizzata rispetto al metodo dell'elettroporazione. Sono stati valutati due fattori: l'aumento della concentrazione dei complessi lipofectamina-ribonucleoproteina (LRNPC) (5% vs. 10%) e la concentrazione della ribonucleoproteina all'interno dei complessi (1xRNP vs. 2xRNP).

È stato osservato che l'aumento della concentrazione di LRNPC ha avuto un effetto dannoso sullo sviluppo embrionale e un conseguente effetto sul numero di embrioni mutanti. Il gruppo del 5% aveva una velocità di esplosione mutante simile al metodo dell'elettroporazione (rispettivamente 5,52% e 6,38%). L'aumento della concentrazione di ribonucleoproteina all'interno dei complessi non ha avuto alcun effetto sul tasso di blastocisti e sul tasso di mutazione, con il tasso di blastocisti mutanti simile sia nei gruppi di lipofezione 1xRNP e 2xRNP che nel gruppo di elettroporazione (1,75% , 3,60% e 3,57%, rispettivamente).

In conclusione, si dimostra che è possibile produrre embrioni knock-out mediante lipofezione di ovociti suini con zona pellucida intatta con efficienze simili a quelle dell'elettroporazione, sebbene sia necessaria un'ulteriore ottimizzazione, principalmente in termini di utilizzo di vescicole più efficienti per l'incapsulamento con composizioni diverse.

Piñeiro-Silva C, Navarro-Serna S, Belda-Pérez R, Gadea J. Production of Genetically Modified Porcine Embryos via Lipofection of Zona-Pellucida-Intact Oocytes Using the CRISPR/Cas9 System. Animals. 2023; 13(3):342. https://doi.org/10.3390/ani13030342