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Tecniche di laboratorio per valutare la riposta immunitaria anticorpale nei suini

In questo articolo si spiegano le differenze tra i vari test di laboratorio: ELISA, sieroneutralizzazione (SN), inibizione dell'emaglutinazione (HI), e IPMA...

ELISA (test enzimatico di immunoassorbimento)

La tecnica ELISA è molto utilizzata per la rilevazione quantitativa di anticorpi nei confronti dei patogeni nei fluidi biologici ed ha una specificità e sensibilità elevate. Si realizza in 96 pozzetti con micro-titolazione e si basa sull'interazione antigene-anticorpo in una reazione enzimatica (colorimetrica, fluorescente o chemiluminescente). I valori di densità ottica (OD dall'inglese), misurati mediante spettrofotometro, possono essere direttamente o indirettamente proporzionali alle quantità/concentrazioni degli anticorpi rilevati.

Per rilevare gli anticorpi totali anti-virali o antibatterici/micoplasmi, si usa un tipo di ELISA indiretto nel quale si fissa un antigene del patogeno alla fase solida (i pozzetti), incubando il campione per produrre un complesso antigene-anticorpo. Successivamente, si aggiunge un anticorpo secondario coniugato per generare un segnale di lettura. Questo sistema permette di valutare molti campioni con un solo anticorpo secondario coniugato.


Figura 1: ELISA indiretto per rilevare gli anticorpi anti-clamidia nel siero
Figura 1: ELISA indiretto per rilevare gli anticorpi anti-clamidia nel siero

I test ELISA competitivi e di inibizione quantificano gli anticorpi del campione in funzione della capacità di interferire con un controllo pre-titolato. In entrambi i tipi di test, si aggiunge il campione ad un sistema pre-titolato e si determina l'attività dell'unione a partire dal grado di interferenza.

Per esempio, per rilevare la risposta umorale nei confronti della PRRS si utilizza la proteina N del virus per catturare tutti gli anticorpi specifici nei confronti del PRRSv in contenitori con 96 pozzetti ricoperti di antigeni. Dopo di che, si aggiunge un anticorpo secondario coniugato con perossidasi per visualizzare gli anticorpi anti-PRRSv catturati.

La risposta immunitaria umorale varia tra i vari soggetti ed i livelli di anticorpi rilevati non riflettono necessariamente la virulenza del ceppo di PRRSv. Inoltre, gli anticorpi materni possono interferire, generando falsi positivi. In genere, gli anticorpi ELISA permettono di rilevare gli anticorpi totali, che sono l'insieme di cellule plasmatiche circolanti e cellule B di memoria specifiche per certi patogeni; per cui, per rilevare adeguatamente la risposta umorale di memoria, è fondamentale la rilevazione degli anticorpi neutralizzanti dei virus direzionati contro epitopi immunodominanti. Il rilevamento degli anticorpi totali con ELISA può dare utili informazioni rispetto alla sieroconversione e dell'effetto di stimolazione indotto da vaccini e/o infezioni pregresse.

Seroneutralizzazione dei virus(SN)

Il test di SN permette di rilevare e di quantificare gli anticorpi neutralizzanti specifici per un virus in un campione di siero.Normalmente, i campioni sono pre-incubati in una serie di diluizioni di quantità conosciute di virus, dopo di che si aggiungono alle cellule diana sensibili l'infezione virale. Questo permette che i virus non neutralizzati infettino le cellule rendendo possibile la determinazione di quale sia la diluizione maggiore in grado di neutralizzare l'infezione virale e della presenza dell'effetto citopatico.

I test di SN sono molto sensibili e specifici, misurano il titolo anticorpale neutralizzante dopo l'infezione o vaccinazione. La quantificazione del titolo può essere basata sulla presenza o assenza di effetto citopatico o sull'evidenza di infezione virale mediante una tecnica immunoreattiva. Il test SN è utile per valutare il livello di reattività crociata sierologica tra gli antisieri vaccinali e gli isolamenti virali per valutare e correllare l'immunità crociata.

Figura 2a: sieroneutralizzazione (SN) per la rilevazione  degli anticorpi vs herpesvirus bovino tipo 1 (BHV-1) nel siero.
Figura 2a: sieroneutralizzazione (SN) per la rilevazione  degli anticorpi vs herpesvirus bovino tipo 1 (BHV-1) nel siero.

Figura 2b: Sieroneutralizzazione (SN) per la rilevazione degli anticorpi vs il virus della diarrea virale bovina (BVDv) nel siero.
Figura 2b: Sieroneutralizzazione (SN) per la rilevazione degli anticorpi vs il virus della diarrea virale bovina (BVDv) nel siero.

Test di emoagglutinazione (HI)

Si tratta di un test sierologico per la rilevazione di anticorpi basato sul principio che l'emoagglutinina dei virus dell'influenza o di altri virus, hanno un effetto emoagglutinante sui globuli rossi, per cui, è il metodo standard per l'identificazione degli anticorpi anti-influenza. Questo significa che il sangue si coagula quando vengono aggiunti questi virus, dato che i globuli rossi si uniranno all'emoagglutinina della superficie virale.

Gli anticorpi specifici indotti come risposta immunitaria umorale all'infezione o vaccinazione con il virus, possono inibire l'agglutinazione nell'unirsi con le emoagglutinine.

Se il campione contiene anticorpi specifici nei confronti dell'emoagglutinina, quando il virus dell'influenza viene aggiunto, si produce una reazione antigene-anticorpo. Sarà evidente con l'aggiunta successiva di globuli rossi: non si agglutineranno perché la reazione viene inibita.

Il titolo sierologico può essere usato per determinare le diluizioni, le quali vengono inibite comunque con l'emoagglutinazione. Il valore reciproco della maggior diluizione dà il titolo anticorpale.

Figura 3: Test dell'emoagglutinazione per il rilevamento degli anticorpi anti-Brucella nel siero.
Figura 3: Test dell'emoagglutinazione per il rilevamento degli anticorpi anti-Brucella nel siero.

Test dell'immunoperossidasi in monostrato (IPMA Immunoperoxidase monolayer assay)

Il test IPMA è molto utilizzato per il rilevamento di anticorpi contro i virus, specialmente quelli che non hanno effetto citopatico, come il PCV2. Gli anticorpi neutralizzanti (NA) sono i principali responsabili della protezione e della scomparsa dell'infezione. Esistendo una correlazione positiva tra i titoli anticorpali dell'IPMA e quelli della VNA, i titoli del test IPMA possono considerarsi una misurazione indiretta degli NA. Il test di IPMA non è quello di prima scelta per la diagnosi di routine perché dipende dalle colture cellulari infette dai virus e perché si perde molto tempo analizzando molti campioni di siero. Per questo motivo, spesso il test IPMA non viene scelto a scapito di test più automatizzati che hanno una lettura obiettiva finale, per esempio l'ELISA.

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